Mutagénesis dirigida del conector interdominio ácido FVIIIa3 del factor VIII de la coagulación como estrategia para favorecer la cristalización de sus complejos con la trombina
Las enfermedades cardiovasculares representan una de las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial, lo que se traduce en un fuerte impacto económico en el sector salud. El factor VIII (FVIII) es un cofactor esencial en los procesos hemostáticos que participa en la formación del...
Saved in:
| Main Authors: | , , , |
|---|---|
| Format: | Article |
| Language: | English |
| Published: |
Instituto Tecnológico de Costa Rica
2019-10-01
|
| Series: | Tecnología en Marcha |
| Subjects: | |
| Online Access: | https://revistas.tec.ac.cr/index.php/tec_marcha/article/view/4789 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| _version_ | 1850254987626545152 |
|---|---|
| author | Jeremy Rojas-Murcia Silvia Arce-Solano Pablo Fuentes-Prior Erick Hernández-Carvajal |
| author_facet | Jeremy Rojas-Murcia Silvia Arce-Solano Pablo Fuentes-Prior Erick Hernández-Carvajal |
| author_sort | Jeremy Rojas-Murcia |
| collection | DOAJ |
| description |
Las enfermedades cardiovasculares representan una de las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial, lo que se traduce en un fuerte impacto económico en el sector salud. El factor VIII (FVIII) es un cofactor esencial en los procesos hemostáticos que participa en la formación del coágulo ante alguna señal de daño vascular. La proteasa trombina es el principal activador fisiológico del FVIII, pero los mecanismos moleculares de reconocimiento del FVIII por la trombina y la formación de los complejos transitorios Michaelis-Menten correspondientes aún no se han descrito en detalle. La cristalografía de rayos X es una técnica que permite resolver la estructura 3D de complejos proteicos, pero requiere la cristalización previa de la muestra a estudiar. Con el objetivo de favorecer la formación de cristales del FVIIIa3 humano (residuos Glu1649-Arg1689) acomplejado con la trombina, se realizó mutagénesis dirigida para generar los doble-mutantes FVIIIa3 (R1689Q, G1690P) y FVIIIa3 (R1689G, G1690P). Estos fragmentos fueron sobreexpresados de forma heteróloga y purificados, obteniendo rendimientos de ~1.5 mg por cada litro de cultivo bacteriano. Esto permitió generar los complejos proteicos FVIIIa3 (R1689Q, G1690P)•trombina y FVIIIa3 (R1689G, G1690P)•trombina en cantidades suficientes para explorar sus espacios de solubilidad de forma extensiva. En total, en cada caso se evaluaron entre 630 y 820 condiciones de cristalización distintas. A partir de esta búsqueda inicial se obtuvo algún tipo de precipitado cristalino en 22 condiciones, 10 de las cuales lograron ser optimizadas para obtener monocristales de alta calidad para posteriores ensayos de difracción con rayos X.
|
| format | Article |
| id | doaj-art-5f49d7a1648d46aeaf8a559f17fa4a64 |
| institution | OA Journals |
| issn | 0379-3982 2215-3241 |
| language | English |
| publishDate | 2019-10-01 |
| publisher | Instituto Tecnológico de Costa Rica |
| record_format | Article |
| series | Tecnología en Marcha |
| spelling | doaj-art-5f49d7a1648d46aeaf8a559f17fa4a642025-08-20T01:57:00ZengInstituto Tecnológico de Costa RicaTecnología en Marcha0379-39822215-32412019-10-0132410.18845/tm.v32i4.47894098Mutagénesis dirigida del conector interdominio ácido FVIIIa3 del factor VIII de la coagulación como estrategia para favorecer la cristalización de sus complejos con la trombinaJeremy Rojas-Murcia0Silvia Arce-Solano1Pablo Fuentes-Prior2Erick Hernández-Carvajal3Instituto Tecnológico de Costa RicaInstituto Tecnológico de Costa RicaHospital de la Santa Creu i Sant PauInstituto Tecnológico de Costa Rica Las enfermedades cardiovasculares representan una de las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial, lo que se traduce en un fuerte impacto económico en el sector salud. El factor VIII (FVIII) es un cofactor esencial en los procesos hemostáticos que participa en la formación del coágulo ante alguna señal de daño vascular. La proteasa trombina es el principal activador fisiológico del FVIII, pero los mecanismos moleculares de reconocimiento del FVIII por la trombina y la formación de los complejos transitorios Michaelis-Menten correspondientes aún no se han descrito en detalle. La cristalografía de rayos X es una técnica que permite resolver la estructura 3D de complejos proteicos, pero requiere la cristalización previa de la muestra a estudiar. Con el objetivo de favorecer la formación de cristales del FVIIIa3 humano (residuos Glu1649-Arg1689) acomplejado con la trombina, se realizó mutagénesis dirigida para generar los doble-mutantes FVIIIa3 (R1689Q, G1690P) y FVIIIa3 (R1689G, G1690P). Estos fragmentos fueron sobreexpresados de forma heteróloga y purificados, obteniendo rendimientos de ~1.5 mg por cada litro de cultivo bacteriano. Esto permitió generar los complejos proteicos FVIIIa3 (R1689Q, G1690P)•trombina y FVIIIa3 (R1689G, G1690P)•trombina en cantidades suficientes para explorar sus espacios de solubilidad de forma extensiva. En total, en cada caso se evaluaron entre 630 y 820 condiciones de cristalización distintas. A partir de esta búsqueda inicial se obtuvo algún tipo de precipitado cristalino en 22 condiciones, 10 de las cuales lograron ser optimizadas para obtener monocristales de alta calidad para posteriores ensayos de difracción con rayos X. https://revistas.tec.ac.cr/index.php/tec_marcha/article/view/4789Enfermedades cardiovascularestrombinafactor VIIImutagénesis dirigidacristalización de proteínas |
| spellingShingle | Jeremy Rojas-Murcia Silvia Arce-Solano Pablo Fuentes-Prior Erick Hernández-Carvajal Mutagénesis dirigida del conector interdominio ácido FVIIIa3 del factor VIII de la coagulación como estrategia para favorecer la cristalización de sus complejos con la trombina Tecnología en Marcha Enfermedades cardiovasculares trombina factor VIII mutagénesis dirigida cristalización de proteínas |
| title | Mutagénesis dirigida del conector interdominio ácido FVIIIa3 del factor VIII de la coagulación como estrategia para favorecer la cristalización de sus complejos con la trombina |
| title_full | Mutagénesis dirigida del conector interdominio ácido FVIIIa3 del factor VIII de la coagulación como estrategia para favorecer la cristalización de sus complejos con la trombina |
| title_fullStr | Mutagénesis dirigida del conector interdominio ácido FVIIIa3 del factor VIII de la coagulación como estrategia para favorecer la cristalización de sus complejos con la trombina |
| title_full_unstemmed | Mutagénesis dirigida del conector interdominio ácido FVIIIa3 del factor VIII de la coagulación como estrategia para favorecer la cristalización de sus complejos con la trombina |
| title_short | Mutagénesis dirigida del conector interdominio ácido FVIIIa3 del factor VIII de la coagulación como estrategia para favorecer la cristalización de sus complejos con la trombina |
| title_sort | mutagenesis dirigida del conector interdominio acido fviiia3 del factor viii de la coagulacion como estrategia para favorecer la cristalizacion de sus complejos con la trombina |
| topic | Enfermedades cardiovasculares trombina factor VIII mutagénesis dirigida cristalización de proteínas |
| url | https://revistas.tec.ac.cr/index.php/tec_marcha/article/view/4789 |
| work_keys_str_mv | AT jeremyrojasmurcia mutagenesisdirigidadelconectorinterdominioacidofviiia3delfactorviiidelacoagulacioncomoestrategiaparafavorecerlacristalizaciondesuscomplejosconlatrombina AT silviaarcesolano mutagenesisdirigidadelconectorinterdominioacidofviiia3delfactorviiidelacoagulacioncomoestrategiaparafavorecerlacristalizaciondesuscomplejosconlatrombina AT pablofuentesprior mutagenesisdirigidadelconectorinterdominioacidofviiia3delfactorviiidelacoagulacioncomoestrategiaparafavorecerlacristalizaciondesuscomplejosconlatrombina AT erickhernandezcarvajal mutagenesisdirigidadelconectorinterdominioacidofviiia3delfactorviiidelacoagulacioncomoestrategiaparafavorecerlacristalizaciondesuscomplejosconlatrombina |